人造血液嘗試始于七十多年前，1900年，奧地利醫(yī)學家卡爾·蘭德斯坦納發(fā)現(xiàn)了ABO血型，讓輸血救人成為了可能。目前，接受手術(shù)、癌癥治療和創(chuàng)傷治療的患者所需的血液供應依賴于志愿獻血者。由于需求量大，研發(fā)人造血液以替代人自身血液的想法便產(chǎn)生了。到了20世紀中后期，由于獻血和輸血造成一些傳染病如艾滋病、乙肝、丙肝等的傳播和流行，也讓人對輸血用血產(chǎn)生恐懼，因此人們正在努力開發(fā)一種更安全、更容易獲得的血液供應來源。
這一挑戰(zhàn)通過可能的血液嫁接來解決，利用胚胎細胞、骨髓細胞或誘導干細胞在體外產(chǎn)生血細胞。通過癌基因能夠增加細胞增殖和減少細胞死亡的能力，來促進通常難以連續(xù)培養(yǎng)的紅系祖細胞系的細胞生長，往往在培養(yǎng)中細胞系有強勁的增長，但細胞群表現(xiàn)出多異質(zhì)表型。由于Cytena克隆篩選單細胞打印系統(tǒng)（single-cell printer™，scp™）能夠高通量生成單細胞克隆，以識別具有理想紅系標記表達的克隆。利用這一工作流程，獲得200多個單克隆可用于進一步的表達標記分析。
本研究為了實現(xiàn)分化的去核血細胞的持續(xù)供應，開發(fā)了從轉(zhuǎn)染到單細胞克隆的工作流程，以選擇克隆進一步分化為成熟的紅細胞(圖1)。首先，將5種不同的癌基因(c-myc, BCL-XL, SV40, geT, Bmi-1, LhX-2)單獨或成對地轉(zhuǎn)染到來自CD34+干細胞的紅系祖細胞系中。
圖1 紅系細胞克隆生成流程
注：轉(zhuǎn)染48小時后，通過向培養(yǎng)物中添加dox激活癌基因表達，從而實現(xiàn)持續(xù)培養(yǎng)。使用single-cell printer™進行單細胞克隆的篩選，挑出具有表面標記的特異性單克隆，在通過添加干細胞因子(SCF)和促紅細胞生成素(EPO)進一步分化，進一步分化為紅系細胞。
轉(zhuǎn)染48小時后，通過添加強力霉素(dox)激活癌基因表達。發(fā)現(xiàn)個體癌基因轉(zhuǎn)導不會導致細胞永生化，只有聯(lián)合轉(zhuǎn)導c-myc和BCL-XL才能使紅系前體細胞永生化，細胞可以在培養(yǎng)中保存并增殖一年以上(圖2A)，除了長期培養(yǎng)的能力外，永生化細胞還表現(xiàn)出早期造血祖細胞的典型標志物，包括CD34very lowCD45+/-CD133+/-CD71+CD44highCD105highCD235avery low。然而，去除dox致癌基因表達失活，使進一步分化成為可能(圖2B)。
注：圖2(A)永生化紅系祖細胞的增殖率。(B)去除dox降低了三種不同細胞克隆的c-myc和BCL-XL癌基因的mRNA表達(編號8,29和34)。
與傳統(tǒng)方法相比，single-cell printer™提供了一種高通量分離單細胞克隆的方法，用于進一步的下游分析和篩選。此技術(shù)基于類似噴墨的原理，將細胞樣品加入至包含微流體結(jié)構(gòu)的芯片中，芯片的底部有一個噴嘴，自由飛行的小液滴在那里被分配，對噴嘴進行連續(xù)成像，以確定產(chǎn)生的液滴中是否含有0、1或多個細胞，如果一個液滴含有一個細胞，它將被分配到目標孔板，如果液滴不包含細胞/多個細胞，液滴將作為廢物處理。
紅系祖細胞被分配到5個充滿半固體培養(yǎng)基的96孔板(兼容384孔板)。連續(xù)的五張圖像(圖3A)作為單克隆源性的保證，并確保只分配了一個細胞。經(jīng)統(tǒng)計有97.7%的孔(469/480)分配到單個細胞，其中超過200個可以形成單克隆，在進一步分析形態(tài)和表面標記物中發(fā)現(xiàn)表達較理想(CD71、CD45、CD34、CD235a)。從培養(yǎng)物中去除Dox，在7天內(nèi)進一步分化為產(chǎn)生血紅蛋白的細胞(圖3B)，突出了可能發(fā)育為成熟紅細胞的潛力。
注：圖3(A)single-cell printer™記錄沉積到目標板中的單個細胞來源的克隆性保證，單細胞沉積效率為97.7%。(B)紅系祖細胞克隆(29)進行進一步分化，去除dox，加入SCF和EPO。通過染色顯示，培養(yǎng)物中存在產(chǎn)生血紅蛋白的細胞。
本研究表明，通過轉(zhuǎn)染c-myc和BCL-XL癌基因，典型的非分裂前體RBC前體可以獲得永生化。所得到的細胞系是異質(zhì)的，需要單細胞克隆來篩選理想的細胞特征。與傳統(tǒng)方法相比，single-cell printer™在保持細胞活力的同時，實現(xiàn)了高通量、穩(wěn)健的單細胞克隆開發(fā)方法，能夠產(chǎn)生超過200個克隆，這些克隆后來被進一步分化并鑒定為具有關(guān)鍵的祖細胞標記物。
參考文獻
single-cell printer™ | Generating single-cell clones of immortalized red blood cell (RBC) precursors using single-cell dispensing. Romy Kronstein Widemann1, Stefan Zimmermann2, Torsten Tonn1.
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Cytena公司潛心研究單細胞打印機（single-cell printer™）技術(shù)多年，不斷升級設(shè)備功能，以一貫溫和的分選原理、更加快速的分選效率、更加簡易的操作步驟，助力抗體、細胞治療、基因治療、干細胞等研究領(lǐng)域的客戶快速搭建單細胞篩選平臺。艾貝泰生物科技有限公司作為Cytena的單細胞打印機總代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的售前售后服務(wù)。
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